Analýza obrazu

  Způsobů hodnocení histologických řezů je jistě mnoho. Předkládáme jednu z možností kvantifikace histochemického průkazu na řezech, který je založen na detekci rozdílů v barvení pletiv, buněk nebo buněčného obsahu. V těchto několika odstavcích stručně nastiňujeme postup hodnocení mikroskopických snímků řezů, který je rozveden do detailů v následujících kapitolách a lekcích.

    Výchozím materiálem pro analýzu obrazu obecně jsou kvalitní snímky kvalitních, dobře obarvených histologických řezů. V našem případě to byly 5 µm silné řezy somatických embryí smrku zalitých do metakrylátové pryskyřice (Technovit 7100) a obarvených toluidinovou modří. Toto metachromatické barvivo barví rostlinné struktury různými barevnými odstíny podle jejich chemického složení. V případě řezů somatickými embryi smrku se barví modře celulózní buněčné stěny a jádra, zeleně nebo zeleno-modře fenolické látky uložené ve vakuolách buněk. Mikroskopické snímky vybraných řezů jsme analyzovali na základě těchto barevných rozdílů. Naším cílem bylo zjistit poměr plochy, kterou zaujímají buňky s obsahem fenolických látek ve vakuolách, vůči celé ploše řezu. 

   Pro hodnocení snímků jsme využili nástroje programu ImageJ (Rueden et al., 2017; Schindelin et al., 2012; Schindelin, J., et al., 2015; Schneider et al., 2012), který je volně ke stažení na stránce https://imagej.net nebo https://fiji.sc/. Mikroskopické snímky získané pomocí programu NIS-Elements firmy Laboratory Imaging a uložené ve formátu JPEG 2000 jsme museli nejprve v ImageJ upravit, abychom usnadnili analýzu obrazu.

  Dalším postupným cílem bylo takové digitální zpracování obrazu, které by vedlo k odlišení buněk akumulujících fenolické látky od těch, které je neobsahují. To znamená, že bylo třeba provést tzv. segmentaci obrazu. Segmentace obrazu je soubor různých metod, které (slovy definice ve Wikipedii) "slouží k automatickému rozdělení vlastního obrazu na oblasti se společnými vlastnostmi,  které obvykle mají nějaký smysluplný význam." Identifikace oblastí nebo struktur zájmu ve snímku umožňuje jejich kvantifikaci a další analýzu. K segmentaci snímků jsme využili plugin Trainable Weka Segmentation (TWS; Arganda-Carreras et al., 2017), který je integrován do ImageJ. Informace o tomto pluginu jsou k dispozici na stránce https://imagej.net/Trainable_Weka_Segmentation#Train_classifier. TWS umožňuje uživateli definovat třídy objektů nebo struktur na snímku. Tato metoda segmentace je založena na strojovém učení tzv. klasifikátoru, který se učí rozpoznávat struktury na snímku na základě barevných značek (traces), které do snímku ručně kreslí uživatel a ručně přiřazuje do předem nadefinovaných tříd jednotlivých struktur. Každé třídě je defaultně přiřazena jedna barva. Každá značka je tak vlastně jednou oblastí zájmu (region of interest - ROI). Podstatou této metody je klasifikace vlastností pixelů jednotlivých oblastí snímku přiřazovaných do tříd. Po tréninku je klasifikátor  aplikovatelný na další obrázky, na kterých provede segmentaci. 

 Po několika kolech tréninku klasifikátoru a přidávání dalších značek do tříd jsme získali segmentovaný obraz se strukturami vyznačenými v barvách odpovídajících jednotlivým třídám a černobílé pravděpodobnostní mapy pro jednotlivé třídy. Tyto mapy ukazují všechny pixely, které s největší pravděpodobností náležejí do dané třídy. V našem případě jsme nadefinovali čtyři třídy - pozadí (background), buněčná stěna (cell wall), buňky bez fenolických látek (cell no phenolics) a buňky s fenolickými látkami (cell with phenolics). Získali jsme proto jeden barevný segmentovaný obraz (označen v TWS jako Classified image) a čtyři pravděpodobnostní mapy. 

   Pravděpodobnostní mapu třídy buňky s fenoly jsme pomocí nástrojů programu ImageJ naprahovali tak, abychom vytvořili dvě oblasti zájmu - ROI. Jednu pro celý řez a druhou pro oblast buněk obsahujících fenolické látky. Plochu těchto dvou ROI jsme změřili. 

   Výsledkem analýzy obrazu byl odhad plochy, kterou zaujímají buňky akumulující fenoly, v ploše celého řezu. Přesnost tohoto odhadu závisí na úspěšnosti segmentace obrazu.

 

---